編者按

當(dāng)前，基因編輯技術(shù)的不斷發(fā)展，為治療各種遺傳性和獲得性疾病提供了新的可能性。2020年，CRISPR基因編輯技術(shù)獲得諾貝爾獎(jiǎng)；2023年12月，美國FDA批準(zhǔn)了首款基于CRISPR的基因編輯療法上市，用于治療鐮狀細(xì)胞病（SCD），基因編輯正式邁入2.0時(shí)代；與此同時(shí)，每年有數(shù)千篇基因編輯相關(guān)研究論文發(fā)表，都彰顯出其在生命科學(xué)和人類醫(yī)學(xué)研究中的巨大潛力。

今天，我們特別關(guān)注一項(xiàng)2024年2月蘇黎世大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)在《Cell》（IF：64.5）發(fā)表的題為《Past, present, and future of CRISPR genome editing technologies》的研究綜述，該綜述回顧了基因編輯技術(shù)的發(fā)展歷程，并詳細(xì)介紹了CRISPR-Cas系統(tǒng)的工作原理，強(qiáng)調(diào)了基因編輯應(yīng)用在研究和治療方面的潛力和挑戰(zhàn)。

文章題目

Past, present, and future of CRISPR genome editing technologies

第一作者：Martin Pacesa,?Oana Pelea,?Martin Jinek

通訊作者：Martin Jinek

通訊單位：蘇黎世大學(xué)生物化學(xué)系

雜志：Cell?

影響因子：64.5/Q1

文章鏈接：

10.1016/j.cell.2024.01.042

01-基因編輯技術(shù)的發(fā)展史

基因編輯最初源于真核生物DNA修復(fù)領(lǐng)域的進(jìn)步。20世紀(jì)90年代初期，利用I-SceI等歸巢內(nèi)切酶進(jìn)行的開創(chuàng)性研究表明，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中誘導(dǎo)靶向雙鏈斷裂(DSB)可刺激靶位點(diǎn)的同源重組，這確立了使用產(chǎn)生DSB的核酸酶進(jìn)行基因組編輯的概念。

由于需要能識別真核生物基因組中單個(gè)位點(diǎn)的長識別位點(diǎn)的多種核酸酶，開發(fā)了基于非特異性DNA內(nèi)切酶與序列特異性DNA結(jié)合模塊串聯(lián)陣列的復(fù)雜融合工程核酸酶。因此，21世紀(jì)初引入的鋅指核酸酶 （ZFN），2010-2011年引入的轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（TALEN），為基因組編輯奠定了基礎(chǔ)，但ZFN和TALEN繁瑣復(fù)雜的設(shè)計(jì)和較高的成本限制了它們的使用。

由于RNA 引導(dǎo)的 CRISPR 相關(guān) （Cas） 核酸酶，其編程簡單、特異性和多功能性，因此，該項(xiàng)發(fā)現(xiàn)和開發(fā)標(biāo)志著基因編輯革命性的轉(zhuǎn)變。2007 年，原核生物CRISPR-Cas 系統(tǒng)被證明具有適應(yīng)性基因組防御機(jī)制，可識別和靶向與病毒（噬菌體）和其他可移動(dòng)遺傳元件相關(guān)的外源核酸。2012 年發(fā)表的生化研究表明，Cas9 起著 DNA 裂解核酸內(nèi)切酶的作用其特異性由CRISPR RNAs（ crRNA） 和trans-activating crRNA （tracrRNA） 組成的雙 RNA 向?qū)ЫY(jié)構(gòu)確定。通過將 tracrRNA 和 crRNA 集成到single guide RNA（sgRNA） 中，進(jìn)一步簡化了 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)，因此，可通過設(shè)計(jì)具有匹配序列的sgRNA，將Cas9靶向到特定的基因組位點(diǎn)。

RNA引導(dǎo)Cas9 DNA切割活性的發(fā)現(xiàn)引發(fā)了一場將其重新用于基因組編輯的競賽，在2013年初的幾項(xiàng)研究中達(dá)到頂峰，這些研究報(bào)告稱，在真核細(xì)胞中表達(dá)Cas9和特定sgRNA可在目標(biāo)基因組位點(diǎn)進(jìn)行基因修飾。

圖1. CRISPR基因組編輯的分子原理

02-基因編輯技術(shù)與方法

CRISPR-Cas核酸酶的可編程性使其能夠產(chǎn)生位點(diǎn)特異性的DNA雙鏈斷裂，從而使其能夠快速適應(yīng)基因組編輯技術(shù)。來自化膿鏈球菌的典型Cas9蛋白（SpCas9）是第一個(gè)被用于基因組編輯的Cas核酸酶，由于其固有的高活性和特異性，目前仍然是最廣泛使用的基因編輯器。Cas12a是一種起源于V型CRISPR-Cas系統(tǒng)的Cas核酸酶，在Cas9之后幾年被發(fā)現(xiàn)，同樣被用于基因組編輯。與Cas9不同，Cas12a不需要tracerRNA進(jìn)行激活，這一特點(diǎn)已被用于體內(nèi)多重編輯。

自從首次展示基于CRISPR的基因編輯以來，該領(lǐng)域以前所未有的速度發(fā)展?；贑as9和Cas12a核酸酶的第一代DSB依賴性基因組編輯器的能力已經(jīng)通過不斷創(chuàng)新得到增強(qiáng)，不僅提高了這些工具的多功能性，還完善了其精確性，并最大限度地減少了意外編輯后果。然而，由于脫靶編輯活性和靶DSB潛在的基因毒性作用(包括p53的誘導(dǎo))，對其安全性的擔(dān)憂仍然存在。

為了減少意外編輯的發(fā)生，已經(jīng)探索了許多方法來精確控制CRISPR基因組編輯器的時(shí)空。

01基于DSB的基因編輯器

Cas9和Cas12a核酸酶能夠高效地實(shí)現(xiàn)基因敲除，同時(shí)也提供有限的HDR介導(dǎo)的基因敲入編輯能力。

02堿基編輯器

這種方法通過融合Cas9核酸酶變體(nCas9)和核苷酸修飾酶，使單個(gè)核苷酸直接轉(zhuǎn)化為另一種，無需產(chǎn)生雙鏈斷裂。此方法特別適用于引入特定的點(diǎn)突變（例如A到G或C到T，也可以是A到C或C到G），從而實(shí)現(xiàn)精確的基因校正或引入終止密碼子以實(shí)現(xiàn)精確的基因敲除。

03先導(dǎo)編輯器

該技術(shù)結(jié)合了Cas9核酸酶和反轉(zhuǎn)錄酶（RT），并使用由Cas9 sgRNA與RT模板（RTT）和引物結(jié)合位點(diǎn)（PBS）融合而成的先導(dǎo)編輯引導(dǎo)RNA（pegRNA）。切割非目標(biāo)DNA鏈后，RT可以擴(kuò)展其序列，從而將RTT序列復(fù)制到目標(biāo)位點(diǎn)上。先導(dǎo)編輯能夠?qū)崿F(xiàn)插入、刪除和替換短DNA序列，長度可達(dá)數(shù)十個(gè)核苷酸。

04轉(zhuǎn)錄調(diào)控

這些工具通過將失活的Cas9（dCas9）與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)域（如VP64或KRAB）融合，靶向基因啟動(dòng)子，實(shí)現(xiàn)對基因轉(zhuǎn)錄的RNA引導(dǎo)控制。

05RNA編輯

與基因編輯不同，RNA編輯利用RNA靶向的Cas13核酸酶，在催化活性下用于靶向轉(zhuǎn)錄降解，或在催化失活后與腺苷脫氨酶融合，用于轉(zhuǎn)錄編輯。

圖2. 當(dāng)前的CRISPR編輯技術(shù)

03-基因編輯技術(shù)的應(yīng)用

CRISPR技術(shù)自誕生以來，其在基因編輯領(lǐng)域的應(yīng)用迅速拓展，特別是在基因治療和農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中展現(xiàn)了巨大的潛力和實(shí)際價(jià)值。

CRISPR-Cas9在基因治療中的應(yīng)用

隨著CRISPR-Cas9技術(shù)的不斷成熟，其在基因治療領(lǐng)域的應(yīng)用逐步展現(xiàn)。通過精確修改或修復(fù)病理性基因，CRISPR-Cas9為遺傳性疾病的治療提供了新的可能。

01遺傳疾病的靶向修復(fù)

CRISPR-Cas9技術(shù)能夠針對特定的遺傳缺陷進(jìn)行精確編輯，實(shí)現(xiàn)疾病相關(guān)基因的修復(fù)或功能性調(diào)控，為遺傳病患者帶來了新的希望。如，針對β-地中海貧血和鐮狀細(xì)胞貧血等血液疾病的基因治療已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。

02癌癥治療的研究

利用CRISPR-Cas9技術(shù)靶向癌基因或腫瘤抑制基因，研究人員能夠更深入地理解癌癥的發(fā)生機(jī)制，并探索新的治療方法。

CRISPR技術(shù)在農(nóng)業(yè)和生物研究中的應(yīng)用

在農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，CRISPR技術(shù)的應(yīng)用正在重新定義作物改良和遺傳研究的邊界。

01作物品種改良

通過CRISPR技術(shù)，研究人員可以精確編輯作物基因組，提高作物的產(chǎn)量、耐病性和營養(yǎng)價(jià)值。例如，通過編輯水稻和小麥中的特定基因，提高了其抗旱和抗病性能。

02功能基因的研究

CRISPR技術(shù)在植物和動(dòng)物模型中被廣泛用于功能基因的鑒定和驗(yàn)證，加速了生物學(xué)基礎(chǔ)研究的進(jìn)展。

圖3. CRISPR基因編輯在人類健康領(lǐng)域的應(yīng)用

04-基因編輯新興技術(shù)?

在CRISPR基因編輯技術(shù)快速發(fā)展的今天，新興技術(shù)與方法的探索從未停止。

圖4. 基因組編輯中的新興技術(shù)

01-DNA聚合酶編輯器

該技術(shù)將Cas9缺口酶與DNA聚合酶和單鏈DNA模板的捆綁結(jié)合起來，例如，使用HUH內(nèi)切酶。與初始編輯的一個(gè)關(guān)鍵區(qū)別在于它使用DNA聚合酶而不是逆轉(zhuǎn)錄酶，并且以反式傳遞DNA模板。

02CRISPR相關(guān)轉(zhuǎn)座子

這些天然存在的可移動(dòng)遺傳元件利用CRISPR效應(yīng)復(fù)合物與轉(zhuǎn)座酶蛋白一起進(jìn)行RNA引導(dǎo)轉(zhuǎn)座，將長DNA序列插入特定的基因組位點(diǎn)。

03工程CRISPR整合酶這些技術(shù)是基于將引物編輯器與位點(diǎn)特異性絲氨酸重組酶相結(jié)合。啟動(dòng)編輯最初在目標(biāo)DNA位置引入重組酶，隨后使重組酶催化的大DNA有效載荷插入。

04靶引逆轉(zhuǎn)錄這一過程包括將nickase Cas9與非長末端重復(fù)(non-long terminal repeat，非LTR)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子衍生的逆轉(zhuǎn)錄酶和rna融合。它通過切割目標(biāo)DNA來產(chǎn)生一個(gè)自由的30端逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子相關(guān)RNA的逆轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致目標(biāo)DNA插入。

05表觀遺傳編輯失活的dCas9與DNA甲基化酶和組蛋白修飾酶的融合可以在特定基因組位置進(jìn)行靶向染色質(zhì)修飾，導(dǎo)致基因表達(dá)的遺傳性抑制(CRISPRoff)，而不會(huì)改變潛在的DNA序列。

06RNA編輯技術(shù)RNA編輯是一種相對較新的技術(shù)，它可以直接修改細(xì)胞內(nèi)的mRNA分子，而無需改變DNA本身。這為治療基因疾病提供了一種更安全、更可逆的方法。

07人工智能人工智能和深度學(xué)習(xí)算法在基因編輯領(lǐng)域的應(yīng)用日益增多，它們有助于預(yù)測基因編輯的結(jié)果，提高編輯的精確度和效率，尤其是在治療應(yīng)用中的安全性和有效性。

05-基因編輯技術(shù)的展望

展望未來，基因編輯技術(shù)領(lǐng)域值得進(jìn)一步研究的方向包括開發(fā)特異性更強(qiáng)、免疫原性更低的遞送載體，減少脫靶效應(yīng)，加強(qiáng)對編輯結(jié)果的控制，提高基因組編輯的準(zhǔn)確性和精確度。

與純基于蛋白質(zhì)的技術(shù)相比，核酸引導(dǎo)系統(tǒng)由于其簡單的可編程性和適應(yīng)性，很可能仍將是基因組編輯的核心。然而，它們的應(yīng)用模式可能會(huì)發(fā)生變化，可能會(huì)轉(zhuǎn)向更瞬時(shí)的編輯方法，以最大限度地降低意外的長期遺傳變化或瞬時(shí)遞送的風(fēng)險(xiǎn)，以最大限度地減少基因組破壞和免疫反應(yīng)。

由于第一代技術(shù)已被批準(zhǔn)用于臨床，通過體外編輯治療鐮狀細(xì)胞?。⊿CD）和β-地中海貧血等疾病，體內(nèi)方法也不甘落后，限制未來針對多種疾病的基因組定向療法開發(fā)的瓶頸將不再是缺乏安全、高效或精確的基因組編輯器。主要的挑戰(zhàn)將在于遞送方法，特別是對于血液和肝臟以外的器官及某些細(xì)胞類型的體外遞送。隨著新的遞送載體的開發(fā)以及致病變異及其糾正策略的表征，可能會(huì)極大促進(jìn)CRISPR技術(shù)的應(yīng)用。

在此背景下，基于人工智能方法的興起將使我們能夠準(zhǔn)確地模擬復(fù)雜的基因組編輯環(huán)境，預(yù)測靶向和脫靶編輯結(jié)果，并設(shè)計(jì)出更有能力的基因組編輯器，從而加快實(shí)施安全治療方法的步伐。

然而，倫理和社會(huì)影響，特別是有關(guān)人類種系基因組修改的倫理和社會(huì)影響，仍將是基因組編輯討論的重點(diǎn)。對人類胚胎的研究表明，CRISPR基因組編輯技術(shù)在用于生殖目的的種系編輯方面不夠安全和有效。此外，生殖系編輯的治療作用有限，也許只能使少數(shù)人受益。盡管如此，對基因組編輯技術(shù)規(guī)范整合和責(zé)任管理達(dá)成國際共識的緊迫性怎么強(qiáng)調(diào)都不為過，尤其是考慮到其快速發(fā)展、不斷改進(jìn)和廣泛應(yīng)用。

總之，盡管存在挑戰(zhàn)，CRISPR基因組編輯技術(shù)的未來依然是光明的。它不僅有可能推動(dòng)研究突破，徹底改變?nèi)祟愥t(yī)學(xué)，而且有可能促進(jìn)農(nóng)業(yè)發(fā)展，應(yīng)對生態(tài)挑戰(zhàn)，從而為人類創(chuàng)造更健康、更可持續(xù)的未來奠定基礎(chǔ)。